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1．基因转移方法
（1）特异正常基因的分离与克隆：应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果 ，已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆 ，这是基因治疗的前提，在当代分子生物技术条件下 ，一般来说 ，只要有基因探针和准确的基因定位，任何基因都可被克隆 。除此，如今既可人工合成DNA探针 ，还可用DNA合成仪在体外人工合成基因 ，这些都是在基因治疗前，分离克隆特异基因的有利条件。
（2）外源基因的转移：基因转移（gene transfer）是将外源基因导入细胞内 ，其转移方法较多 ，常用的要有下列几类：
1）化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE－葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒 ，直接倾入培养基中与细胞接触 ，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜 ，故可将DNA输入细胞内 ，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下 ，整合基因得以表达 ，细胞亦可传代 。这种方法简单，但效率极低，一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因 。要达到治疗目的 ，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。当然 ，可以通过选择培养的方法来提高转化率 。
2）物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法 。
①电穿孔法：电穿孔法（electroporotion）是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔 ，周围基质中的DNA可渗进细胞 ，但有时也会使细胞受到严重损伤。
②显微注射法：显微注射（microinjection）是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因 ，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞 ，工作耗力费时 。此法用于生殖细胞时，有效率可达10% 。直接用于体细胞却很困难。在动物实验中 ，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞 ，使之表达而传代，这样的动物就称为转基因动物 ，如今成功使用得较多的是转基因小鼠（transgenic mice） ，它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型 。
③脂质体法：脂质体（liposome）法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织 ，使之表达 。
3）同源重组法：同源重组（homologous recombination）是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上 ，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换 ，新基因片段替换有缺陷的片段 ，达到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁组装一Neo基因，则在同源重组后 ，因有Neo基因 ，可在含有新霉素（neomycin）的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的细胞死亡 。对于体细胞基因治疗 ，体外培养细胞的时间不能过长 ，筛选量大，故在临床上应用也受限制难以进行 。今后如能改进技术 ，提高重组率 ，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。
4）病毒介导基因转移：前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移 。病毒介导基因转移（viral mediatedgene transfer）是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体（vector），将外源目的基因通过基因重组技术 ，将其组装于病毒上 ，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体（viral vector） 。如今应用的有两种病毒介导基因转移方法。
①反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒 ，但有反转录酶 ，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组 。反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力 ，可使近100%的受体细胞被感染 ，转化细胞效率高；其次，它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；再者随机整俣的病毒可长期存留 ，一般无害于细胞 ，但也存在缺点：这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞 ，如神经元 。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因 ，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此，人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白 ，以保留其穿透细胞的功能 ，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒（defective virus） 。这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组 ，而该病毒则死亡 。由于病毒整合基因组是随机的 ，所以还是可能激活细胞的原癌基因，以及因随机插入发生插入突变。
在反转录病毒载体中 ，最常用于人类的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV） ，其人工构建的结构 。
②DNA病毒介导载体（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒 、SV40 、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒 。
牛乳头瘤病毒重组后 ，可不插入宿主染色体中引起插入突变 ，又可在宿主染色体外独立复制，并表达出基因产物。有人发现 ，因缺少E1区而致复制缺陷的腺病毒 ，可在表达E1基因的细胞中繁殖 。后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点 。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心 、脑 、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向 。
美国设计了一个新的腺病症载体，它是用一个化学连接器即赖氨酸链（lysine chain）将DNA栓在病毒外壳上 ，这样组成的运输器 ，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达 。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体（adeno virus-polylysine DNA-complex）。
采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：
①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞 ，并能得到大量基因产物 ，对神经细胞 、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；
②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩 ，且感染力不降低；
③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外 ，并持续表达；
④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性 。
前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因 ，而其它病毒只能运输70 00bp的基因 。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。
2．选择靶细胞的原则
这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。
选择靶细胞的原则是：
①必须较坚固 ，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；
②具有增殖优势 ，生命周期长 ，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期；
③易于受外源遗传物质的转化；
④在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞 。使用得较多的是骨髓干细胞 、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等 。许多遗传病与造血细胞有关 ，故可用于如β地贫 、严重复合免疫缺陷病等的基因治疗。皮肤成纤维细胞易于移植和从体内分离 ，又可在培养中生长，并易存活 ，故有人用之于乙型血友病的基因治疗 。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷 ，因此，在家族性高胆固醇血症的治疗中 ，有将低密度脂蛋白（LDL）受体基因转移至肝细胞的尝试 。在动物实验中已证明：β－半乳糖苷酶基因 、ADA基因、小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因都已证明能在肌细胞中表达。
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